Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 5

Spośród 4 wariantów, 2 były chorobotwórcze (w uczestniku DC-2801, z zespołem podwójnej kory mózgowej i uczestniku PAC-902, z pachygrią), a 2 zostały odziedziczone (w uczestniku BFP-801, z pachygrią i uczestniku PH- 23901, z okołokomorową heterotopią guzkową); jeden z odziedziczonych wariantów został zaklasyfikowany jako wariant o niepewnym znaczeniu, a drugi został sklasyfikowany jako łagodny. Z pozostałych 13 wariantów o częstotliwości odczytu alleli alternatywnych mniejszej niż 30%, 5 zostało potwierdzonych za pomocą subklonowania (tabela i tabele S3, S4 i S9 w dodatkowym dodatku). To, czy walidacja zakończyła się sukcesem, było przewidywalne w zależności od stopnia pokrycia: warianty o zasięgu co najmniej 100 ×, szczególnie warianty mozaiki, były bardziej wiarygodne (rysunek 1A), a warianty linii zarodkowej i mozaiki o zasięgu 20 × lub mniej i 60 × lub mniej, prawdopodobnie, były błędami w sekwencjonowaniu nowej generacji (rys. 1A i 1B). Rysunek 2. Rysunek 2. Wykrywanie wariantów za pomocą NGS i Sanger Sequencing. Figura pokazuje odczyty NGS dostosowane do chromatogramów Sangera z amplifikacji DNA i po subklonowaniu dla Uczestnika DC-5103 (Panel A) i Uczestnika DC-4401 (Panel B); warianty (zakreślone nukleotydy) wykryto we frakcji z odczytów, ale zostały pominięte, gdy zastosowano ukierunkowane sekwencjonowanie Sangera. Subklonowanie wykryło warianty w proporcji klonów, a odsetek odczytów NGS był silnie skorelowany z odsetkiem klonów zawierających odczyt mozaiki. NGS odczytuje się zgodnie z chromatogramami Sangera sekwencjonowania z masowej amplifikacji DNA próbek od Uczestnika DC-2101 (Panel C) i Uczestnika PAC-902 (Panel D), a ich rodzice pokazują, że wariant mozaikowy (zakreślony nukleotyd) został wykryty jako mniejszy szczyt , w porównaniu z allelem referencyjnym, sekwencjonowaniem Sangera i powstaniem de novo (tj. był nieobecny u rodziców). W przypadku mutacji splicingowej w uczestniku DC-2101 oprogramowanie przewidujące nie umożliwiło wyboru spośród potencjalnych miejsc akceptorowych składania; dlatego nie przedstawiono żadnego aminokwasu.
Subklonowanie kandydatów na mutacje mozaikowe pozwoliło na niezależne potwierdzenie i kwantyfikację tych mutacji, a częstotliwości odczytu alleli naprzemiennych określane za pomocą subklonowania ściśle odpowiadają tym zdefiniowanym za pomocą sekwencjonowania nowej generacji. Jednak sekwencjonowanie Sangera błędnie klasyfikowało mutacje mozaikowe zarówno w wyższych, jak i niższych zakresach mozaikowatości (ryc. 1C). Cztery mutacje mozaikowate przy częstotliwości odczytu alleli alternatywnych poniżej 17% były całkowicie niewykrywalne przy użyciu sekwencjonowania Sangera, a piąta (u uczestnika DC-2101, u którego wystąpił zespół podwójnej kory) wykazała niewyraźny szczyt widoczny tylko na retrospektywie analiza; te pięć mutacji stanowi 63% wszystkich mutacji mozaikowych zidentyfikowanych w naszym badaniu
[podobne: Fordanserki, polcortolon, amlodypina ]

Powiązane tematy z artykułem: amlodypina Fordanserki polcortolon