Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 7

Korzystając z panelu genów 1, wykryto mutacje u 30% osób z zespołem podwójnej kory mózgowej; 20% mutacji stanowiły mozaiki. Znana powtarzająca się mutacja DCX (R186C) występowała w linii płciowej u uczestnika DC-601 i była somatyczna w uczestniku DC-4601. Zgodnie z oczekiwaniami, mutacja w linii płciowej była związana z grubym pasmem heterotopii zarówno z przodu, jak iz tyłu, podczas gdy mutacja mozaiki, z częstotliwością odczytu allelu alternatywnego około 5% (około 10% zmutowanych komórek), była związana z łagodniejszym fenotypem, ze znacznie cieńszym pasmem heterotopii ograniczonym głównie do odcinków przednich (ryc. S5 oraz tabele S3 i S4 w dodatku uzupełniającym). Wśród osób z polimikrogrią z megalencefalią nie wykryliśmy żadnych wariantów mozaiki, ale wykryliśmy znane patogenne warianty linii zarodowych w dwóch (10%) z nich: AKT3 (R465W) i PIK3CA (A1035V). Wykryliśmy patogenne mutacje w FLNA u ośmiu osób z okołokomorową heterotopią guzkową (13%): siedem mutacji było zarodkowych, a jedna była mozaiką (S1449fs w uczestniku PH-16001, częstotliwość odczytu alleli naprzemiennych, 35%). Ryc. Read more „Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 7”

Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 6

Wszystkie mutacje można łatwo zwalidować za pomocą subklonowania. Chociaż warianty somatyczne obecne na wysokich częstotliwościach alleli były łatwo wykrywane przy użyciu sekwencjonowania Sangera, udział zmutowanego allelu był zawyżony, do tego stopnia, że interpretowano je jako mutacje w linii płciowej (figura 2D i fig. S4 w dodatkowym dodatku) . Osiem zidentyfikowanych mutacji mozaikowych wykazuje bardzo mocne dowody patogenności (tabele S10 i S11 w dodatkowym dodatku). Trzy zostały zgłoszone wcześniej, przewiduje się, że wynikiem będzie niekonserwatywna substytucja missense reszty aminokwasowej, która jest mutantem u innych pacjentów, trzy są przewidywane jako zerowe allele (jeden nonsens, jedno splicing i jedno przesunięcie ramki odczytu), a jeden jest mutacja missense w LIS1; sekwencja aminokwasów LIS1 jest wysoce konserwatywna i praktycznie identyczna między myszą a człowiekiem. Przewidywana proporcja komórek krwi niosących mutację (Tabela 1) została obliczona poprzez podwojenie częstości odczytu naprzemiennego allelu dla heterozygotycznych autosomalnych mutacji u obu płci i dla mutacji związanych z X u samic. W przypadku mutacji w genach związanych z X u samców przewidywana zawartość procentowa zmutowanych komórek była równa częstotliwości odczytu alleli alternatywnych. Read more „Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 6”

Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 5

Spośród 4 wariantów, 2 były chorobotwórcze (w uczestniku DC-2801, z zespołem podwójnej kory mózgowej i uczestniku PAC-902, z pachygrią), a 2 zostały odziedziczone (w uczestniku BFP-801, z pachygrią i uczestniku PH- 23901, z okołokomorową heterotopią guzkową); jeden z odziedziczonych wariantów został zaklasyfikowany jako wariant o niepewnym znaczeniu, a drugi został sklasyfikowany jako łagodny. Z pozostałych 13 wariantów o częstotliwości odczytu alleli alternatywnych mniejszej niż 30%, 5 zostało potwierdzonych za pomocą subklonowania (tabela i tabele S3, S4 i S9 w dodatkowym dodatku). To, czy walidacja zakończyła się sukcesem, było przewidywalne w zależności od stopnia pokrycia: warianty o zasięgu co najmniej 100 ×, szczególnie warianty mozaiki, były bardziej wiarygodne (rysunek 1A), a warianty linii zarodkowej i mozaiki o zasięgu 20 × lub mniej i 60 × lub mniej, prawdopodobnie, były błędami w sekwencjonowaniu nowej generacji (rys. 1A i 1B). Rysunek 2. Rysunek 2. Wykrywanie wariantów za pomocą NGS i Sanger Sequencing. Read more „Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 5”

Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 4

Warianty wykryte na głębokości większej niż 100 × były bardziej prawdopodobne, że zostaną zatwierdzone. Warianty wykryte na głębokości mniejszej niż 60x (różowa zacieniona powierzchnia) były mniej prawdopodobne, aby zostały zatwierdzone niż te wykryte na głębokości większej niż 60x. Dotyczyło to zwłaszcza wariantów mozaiki. Panel C pokazuje proporcje wariantów mozaiki wykrytych przez sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), która była podobna do tej wykrywanej przez subklonowanie. Gdy zastosowano sekwencjonowanie Sanger, warianty mozaikowe o częstotliwościach alleli poniżej 17% (u uczestników DC-4601, DC-4401, DC-401 i DC-5103, z których wszyscy mieli zespół podwójnej kory mózgowej) nie zostały wykryte, i mutacje obecne na wysokich częstotliwościach alleli (około 35% w uczestniku PH-16001, który miał okołokomorową heterotopię guzkową, i około 23% w uczestniku PAC-902, który miał pachygyrię) przypominały mutacje w linii germinalnej. Wariant mozaikowy uczestnika DC-2101 został pominięty w początkowej analizie i został wykryty jako mały pik tylko przy bezpośrednim badaniu chromatogramu Sanger. Dzięki zastosowaniu ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji udało się z powodzeniem zidentyfikować wszystkie warianty w próbkach kontroli pozytywnej i wykryć mutacje somatyczne o częstotliwościach alleli 1% lub wyższych, gdy głębokość odczytu wynosiła co najmniej 1000 × (rys. Read more „Mutacje somatyczne w mózgowych malformacjach korowych AD 4”